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磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
磷脂酶C（EC 3.1.4.3）是一種水解甘油磷酸酯 C3 位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶，廣泛存在于微生物及動植物的組織和細胞中，在細胞代謝、細胞傳遞、生長發育等方面具有重要作用。
磷脂酶C 催化水解NPPC 產生對硝基ben酚，在 410nm 處有特征吸收峰。
產品名稱 | BR6027-50T/48S | Storage |
提取液：液體 | 50ml | 4℃ |
試劑一：液體 | 55ml | 4℃ |
試劑二：液體 | 25ml | 4℃避光 |
試劑三：液體 | 20ml | 4℃ |
說明書 | 一份 | |
自備儀器和用品：
天平、研缽、超速冷凍離心機、可見分光光度計、1 ml 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。
2. 細胞：按照細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后于 4℃，10000g離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。
3. 血清：直接測定。
空白管 | 測定管 | |
樣品（μl） | 100 | |
試劑一（μl） | 100 |
試劑二（μl） | 500 | 500 | ||
充分混勻，37℃反應 30min | ||||
試劑三（μl） | 400 | 400 | ||
充分混勻，于 1ml 玻璃比色皿，蒸餾水調零，測定 410nm 處吸光值，分別記為 A 空白 管和A 測定管，△A=A 測定管-A 空白管。 | ||||
酶活計算公式：
標準曲線：y = 0.0191x - 0.0103，R2 = 0.9991
1. 按照蛋白濃度計算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC 產生 1nmol 對硝基ben酚所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC 活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解NPPC 產生 1nmol 對硝基ben酚所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC 活性（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ W
3. 按照細胞數量計算
酶活性定義：每 104 個細胞每分鐘水解NPPC 產生 1nmol 對硝基ben酚所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC 活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ 細胞數量
4. 按照液體體積計算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC 產生 1nmol 對硝基ben酚所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC 活性（nmol/min/ml）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反總÷V 樣÷T
= 17.45×（△A+0.0103）
V 反總：反應總體積，1ml；V 樣：加入樣本體積，0.1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min
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